Mechanisms Of Functioning And Control Of Heme Uptake In Gram-Negative Pathogenic Bacteria

Mechanizm wychwytu hemu jest bardzo podobny dla większości Gram-ujemnych bakterii. Ogólny proces pobierania hemu przedstawiono na przykładzie systemu transportu hemu u Yersinia enterocolitica, ludzkiego enteropatogenu (Ryc. 1).

Ryc. 1.

Zidentyfikowano i dobrze scharakteryzowano ponad 30 różnych transporterów hemu, które funkcjonują w błonie zewnętrznej patogenów Gram-ujemnych. Transportery hemu można podzielić na dwie klasy. Do pierwszej należą te, które rozpoznają hem i specyficzne kompleksy białkowe zawierające hem, np. hemoglobinę. Niektóre gatunki bakterii posiadają wiele różnych receptorów tej klasy dla odmiennych hemoprotein. Receptory te mogą być syntetyzowane w ściśle określonych warunkach środowiskowych/niszach ekologicznych organizmu gospodarza (np. u Haemophilus influenzae). Inne gatunki bakterii posiadają jeden typ receptora OM charakteryzujący się zdolnością do wiązania wielu hemoprotein, co świadczy o tym, że rozpoznanie substratu ma miejsce na poziomie cząsteczki hemu. Dobrym przykładem takiego receptora jest HemR u Y. enterocolitica, który jest zdolny do wiązania hemu, hemoglobiny, mioglobiny, kompleksu hemoglobina-haptoglobina, hem-hemopeksyny, hem-albuminy [12, 13]. W ostatnim czasie wykazano, iż Y. enterocolitica koduje dwa receptory hemu, które nazwano HemR1 oraz HemR2. Obydwa geny zlokalizowane są w różnych miejscach w genomie i wchodzą w skład dwóch operonów, hemPRSTUV-1 oraz hemPRST-2. Z prowadzonych badań wynika, iż obydwa receptory są funkcjonalne, chociaż HemR2 wydaje się być mniej efektywny niż HemR1, co może wynikać z niższej ekspresji hem-PRST-2 w porównaniu do hemPRSTUV-1 [14].

Wszystkie cząsteczki transporterów hemu bakterii Gram-ujemnych tworzą w błonie zewnętrznej strukturę β-baryłki zbudowanej z 22 łańcuchów aminokwasowych przyjmujących formę antyrównoległych β-kartek. Dodatkowo posiadają domenę globularną, która może blokować por transportera. Łańcuchy β-kartek tworzą w peryplazmie krótkie pętle, natomiast na powierzchni komórki długie hydrofilowe pętle służące do oddziaływań białko-białko i wiązania hemu bądź hemoprotein. Niezależnie od strukturalnego podobieństwa oraz sekwencji aminokwasowej, wszystkie znane receptory hemu posiadają dwie konserwowane reszty histydyny (np. His128 oraz His461 u HemR Y. enterocolitica), które koordynują hem i są zlokalizowane w konserwowanych domenach niezbędnych dla funkcjonowania receptora, np. w domenie FRAP/NPNL [1, 10]. Proponowany model działania HemR postuluje istnienie TonB-zależnego transferu hemu z His461 do His128, co pozwala na przejście hemu przez kanał w błonie zewnętrznej [12].

Wiele receptorów hemowych wiąże wolny hem lub hem związany z kompleksem białkowym, takim jak hemoglobina lub hemopeksyna. Przykładem są białka FrpB1 Helicobacter pylori i ChuA Campylobacter jejuni, które jak wykazano za pomocą spektrofotometrii UV-VIS, wiążą się z hemem i/lub hemoglobiną [15, 16]. Szczególnym przypadkiem wśród znanych receptorów hemowych jest receptor HpuAB występujący u bakterii z rodzaju Neisseria dla haptoglobiny-hemoglobiny i hemoglobiny [17]. Składa się on z dwóch białek o wielkości 42 kDa (HpuA) i 89 kDa (HpuB). HpuB jest białkiem zależnym od TonB. HpuA jest zewnętrzną lipoproteiną błonową. Oba białka są wymagane do wiązania hemoprotein [18].

Do drugiej klasy transporterów należą te białka, które rozpoznają i pobierają hem w kompleksie z hemoforem. Hemofory to niskocząsteczkowe białka bakteryjne wydzielane z komórki do środowiska. Ich rolą jest wiązanie hemu i dostarczanie go do specyficznych receptorów w błonie zewnętrznej. Główną klasą hemoforów są białka HasA, które zidentyfikowano u wielu patogenów bakteryjnych, w tym Serratia marcescens i Pseudomonas aeruginosa [19–21]. Badania struktury HasA [22, 23], wykazały, że białko to występuje jako monomer o wielkości 19 kDa [22]. Po związaniu hemu hemofor HasA wiąże się z receptorem błony zewnętrznej HasR, co skutkuje przeniesieniem hemu na HasR [19, 24]. Nie do końca wiadomo jakie zmiany strukturalne występują podczas przenoszenia kompleksu HasA/hem na receptor HasR. Wiadomo jedynie, że proces zachodzi nawet w nieobecności ATP, co sugeruje, że transfer ten nie wymaga energii [24].

Jak wspomniano wcześniej, do transportu cząsteczki hemu przez osłony komórkowe, potrzebna jest energia. W procesie tym bierze udział system transportu TonB/ ExbB/ExbD. Chociaż nie określono całkowitego zapotrzebowania na energię potrzebną do transportu, to ustalono, że podczas transportu protonów przez błonę wewnętrzną, z peryplazmy do cytoplazmy, tworzona jest siła protonomotoryczna. W procesie tym bierze udział białko ExbB, którego helisy tworzą w błonie wewnętrznej strukturę poru. Por ma strukturę pentameru utworzonego z helis białka ExbB oraz jednej helisy białka ExbD. Pozostałe hydrofobowe helisy ExbD prawdopodobnie znajdują się w błonie wewnętrznej, poza strukturą utworzonego pentameru [25]. Nie wiadomo, w jaki sposób siła protonomotoryczna jest przekształcana w energię potrzebną do transportu hemu przez błonę, ale zaproponowano dwa mechanizmy. Według jednej hipotezy może to być ruch rotujący białka ExbD, albo działanie białka ExbD jako tłok, wzdłuż centralnej osi ExbB. Ten mechaniczny ruch odbierany jest przez białko TonB, wywołując jego interakcję z receptorem błony zewnętrznej [25]. C-końcowa domena TonB oddziałuje z „TonB box”, tj. z N-końcowym regionem receptora błony zewnętrznej, skierowanym do peryplazmy, który może być odpowiedzialny za transfer energii z kompleksu TonB do receptora hemowego [26].

Często bywa tak, iż w komórce bakteryjnej funkcjonuje kilka różnych systemów wychwytu hemu [10, 27]. Przykładem jest P. aeruginosa, który posiada receptor hemu w błonie zewnętrznej (PhuR), system transporterów ABC (PhuTUV), jak i hemofor HasA wraz z receptorem HasR rozpoznającym kompleks hemofor/ hem [1]. System transportu warunkujący pobieranie hemu związanego w żelazoproteinach u P. aeruginosa jest kodowany przez geny operonu phu (Pseudomonas heme uptake). Gen phuR koduje receptor PhuR, którego funkcja zależy od aktywności TonB. Geny phu-TUV kodują system transportujący zależny od peryplazmatycznego białka wiążącego hem, niezbędny do transportu przez błonę cytoplazmatyczną. System transportu P. aeruginosa kodowany przez operon phuSTUV jest homologiczny do systemu obecnego u Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis i Y. pestis [28, 29].

Kluczową rolę w przenoszeniu hemu przez peryplazmę do błony cytopazmatycznej pełni rozpuszczalne peryplazmatyczne białko wiążące substrat (PBP, periplasmic binding protein). Mechanizm uwalniania hemu z receptora błony zewnętrznej do PBP jest nieznany. Możliwe, że powinowactwo hemu do receptora maleje w wyniku oddziaływania z PBP. Białka PBP zostały podzielone na trzy klasy w zależności od liczby połączeń międzydomenowych. Wszystkie trzy klasy białek charakteryzują się obecnością N-końcowych i C-końcowych globularnych domen, które tworzą szczelinę pomiędzy domenami odpowiedzialną za wiązanie ligandu. Białka należące do klasy I i II mają dwa z trzech połączeń międzydomenowych. Do klasy I należy między innymi białko PBP wiążące maltozę, a do klasy II reduktaza rybonukleotydowa. Oba te białka podlegają dużym zmianom strukturalnym niezbędnym do związania i uwolnienia substratu. Białka klasy III mają jedno połączenie międzydomenowe, które ulega małym zmianom konformacyjnym. Do tej klasy należy między innymi białko wiążące witaminę B₁₂ (BtuF). Białko PhuT P. aeruginosa ma podobną budowę do BtuF, gdzie domeny C- i N-końcowe zawierają pięcioniciowe β-kartki oflankowane α-helisami. Hem jest związany przez tyrozynę w N-końcowej domenie znajdującej się w szczelinie wiążącej hem [1]. Podczas gdy większość odkrytych PBP wiąże się z hemem w stosunku 1:1 HmuT Y. pestis wiąże dwie cząsteczki hemu jednocześnie [30]. Białko to posiada dwie β-kartki połączone α-helisą, jednakże odległość pomiędzy resztami Tyr70 i Arg167 jest większa w porównaniu z innymi PBP. Może to wyjaśniać zdolność HmuT do wiązania więcej niż jednej cząsteczki hemu [30].

Transportery ABC błony cytoplazmatycznej stanowią jedną z większych białkowych superrodzin i są odpowiedzialne za transport substratów przez błonę zależny od ATP. Białka są zbudowane z dwóch transbłonowych domen tworzących kanał translokacyjny oraz dwóch domen cytoplazmatycznych odpowiedzialnych za wiązanie i hydrolizę ATP. Domena transbłonowa transporterów różni się długością i sekwencją aminokwasową, co zapewnia specyficzność substratową. Domena wiążąca ATP jest silnie konserwowana. Transport ten przebiega według modelu „ATP-switching” [1]. W tym modelu peryplazmatyczne białko wiążące hem oddziałuje z domeną transbłonową transportera ABC indukując zmianę jego konformacji. Zmiana ta prowadzi do obniżenia energii aktywacji wymaganej do wiązania ATP z domeną cytoplazmatyczną. Wiązanie ATP indukuje tworzenie zamkniętej formy dimerycznej domeny transbłonowej i skutkuje uwolnieniem hemu do kanału transportowego. Dzięki hydrolizie ATP, następuje translokacja hemu do cytoplazmatycznego białka wiążącego hem. Przyrównanie sekwencji aminokwasowej transporterów ABC wykazało, że wszystkie posiadają dwie konserwowane reszty histydyny zlokalizowane w domenie tworzącej kanał [1].

Cząsteczka hemu obecna w cytoplazmie może powodować efekt cytotoksyczny, dlatego w komórce uruchamiany jest mechanizm katabolizmu cząsteczki. Polega on na degradacji pierścienia protoporfirynowego hemu za pomocą oksygenazy hemowej, co prowadzi do otrzymania labilnego żelaza, biliwerdyny oraz dwutlenku węgla. Bakteryjne oksygenazy są funkcjonalnymi i strukturalnymi homologami eukariotycznych oksygenaz [7, 11, 31].

Białko cytoplazmatyczne Fur u E. coli jest zbudowane z 148 reszt aminokwasowych o łącznej masie 16,8 kDa. W strukturze Fur wyróżnia się dwie domeny: N-terminalną domenę wiążącą DNA (2–84 aa) oraz C-terminalną domenę dimeryzacyjną (85–148 aa). Domena wiążąca zbudowana jest z czterech α-helis (α1, α2, α3, α4), które tworzą motyw uskrzydlonej helisy (motyw WH, winged helix) oraz z dwóch antyrównoległych β-kartek (β1, β2). Za wiązanie DNA odpowiedzialne są glicyna w pozycji 50 oraz alanina w pozycji 64, będące aminokwasami helisy α4. C-terminalna domena dimeryzacyjna zbudowana jest z trzech ułożonych antyrównolegle β-kartek (β3, β4, β5), otoczonych pojedynczą α-helisą (α5). Za dimeryzację odpowiedzialne są β-kartki, które łączą monomery. Co ciekawe, między helisami α5 monomerów, tworzą się liczne oddziaływania hydrofobowe i hydrofilowe. Umożliwiają one uformowanie konserwowanych mostków solnych między asparaginą w pozycji 103 i argininą w pozycji 109 helisy α5 jednego monomeru, a tymi samymi aminokwasami helisy α5 drugiego monomeru. Wszystkie pozostałe aminokwasy helis α5 odpowiedzialne są za wiązanie się z β-kartkami domeny dimeryzacyjnej drugiego monomeru [36, 37].

W budowie białka Fur wyróżnia się dwa miejsca, które charakteryzują się zdolnością do wiązania dwuwartościowych jonów metali, takich jak cynk, mangan, żelazo czy kobalt [38]. W przypadku dużej dostępności jonów Fe²⁺ w środowisku, oba monomery białka wiążą po jednym jonie. Taka sytuacja prowadzi do zmiany pozycji domen wiążących DNA w białku, co zwiększa jego powinowactwo do DNA nawet 1000-krotnie. Kompleks Fe²⁺-Fur wiąże się do regionów promotorowych genów związanych z asymilacją żelaza, uniemożliwiając tym samym przyłączenie się polimerazy RNA i hamując transkrypcję. Można zatem stwierdzić, iż żelazo jest niezbędne do hamowania ekspresji genów znajdujących się pod kontrolą Fur [5]. Co ciekawe, białko Fur zawiera przynajmniej jedno miejsce w dimerze, które może wiązać wyłącznie dwuwartościowe jony cynku [39]. W 1998 roku Jacquamet i wsp., posługując się metodą spektroskopii fotoelektronów w zakresie promieniowania X, wykazali obecność takiego miejsca w białku Fur E. coli, zlokalizowanego w obrębie cystein w pozycji 92 i 95 na C-końcu [40]. Miejsce to nie jest konserwowane i nie występuje u wszystkich bakterii. Cynk wiązany w tych miejscach odpowiedzialny jest za utrzymanie integralności dimeru, nie pełni on natomiast funkcji regulatorowej [36].

Do represji genów, związanych z asymilacją jonów żelaza, dochodzi w przypadku dużego stężenia tego mikroelementu w środowisku. To właśnie wtedy białko Fur wiąże jony Fe²⁺, co powoduje zmianę jego konformacji i umożliwia przyłączenie do regionów promotorowych genów, hamując ich ekspresję. W odwrotnej sytuacji, kiedy stężenie jonów żelaza w środowisku jest zbyt niskie, aby bakterie mogły się namnażać dochodzi do odblokowania ekspresji genów, których produkty są odpowiedzialne za ich asymilację. Ze względu na zbyt małą ilość żelaza nie powstaje kompleks Fe²⁺-Fur i nie dochodzi do zahamowania transkrypcji regulowanych genów [41] (Ryc. 2).

Ryc. 2.

Kompleks Fe²⁺-Fur przyłącza się zazwyczaj między sekwencjami –35 i –10 w obszarze promotorów regulowanych genów. U Y. enterocolitica miejsce wiązania dla tego represora pokrywa się z sekwencją –10 promotora operonu hemPRSTUV-1, jak również hemPRST-2. Wykazano, iż Fur kontroluje w sposób negatywny aktywność obydwu operonów w warunkach nadmiaru żelaza w środowisku [14]. Dodatkowy, wewnętrzny promotor przed genami hemSTUV zidentyfikowano u Y. enterocolitica, Y. pestis oraz Y. pseudotuberculosis, ale transkrypcja tego operonu pozostaje niezależna od Fur [13, 28, 29].

Pierwotnie twierdzono, iż miejsce wiązania Fur do DNA to palindromiczna sekwencja konsensus o długości 19 pz, zwana „Fur box” lub „Iron box” (5’-GATA-ATGAT(A/T)ATCATTATC-3’). Jednakże, w 2000 roku, dzięki analizom footprinting, Escolar i wsp. wykazali, że białko Fur może wiązać fragment DNA większy niż 19 pz [42]. Dzieje się tak, ponieważ często dochodzi do sytuacji, kiedy dwie lub więcej sekwencji typu „Iron box” sąsiaduje ze sobą lub zachodzi na siebie, co sugeruje wiązanie DNA przez wiele kompleksów Fe²⁺-Fur jednocześnie. W rzeczywistości, do promotorów niektórych genów potrafi przyłączyć się kilka kompleksów, które łącznie obejmują obszar o długości nawet 100 pz. Takie sytuacje doprowadziły do reinterpretacji miejsca „Fur box”, jako sekwencji trzech powtórzeń, składających się z motywów o długości 6 pz (5’-NAT(A/T) AT-3’);NAT(A/T)AT; N;AT(A/T)ATN-3’). Powtórzone motywy zwiększają siłę wiązania białka Fur do DNA [5]. Jednakże wspomniane badania nie wyjaśniają dokładnie jak poszczególne dimery Fur są rozmieszczone wzdłuż podwójnej helisy DNA oraz ile sześcionukleotydowych powtórzeń jest wymaganych do związania pojedynczego dimeru. Z kolei Lavrrar i wsp. (2002) sugerowali, iż białko Fur wiąże się z 13 pz motywem typu 6–1–6 [43]. Taki układ pozwala obu dimerom białka Fur wiązać się do miejsc „Fur box”, znajdujących się po przeciwnych stronach podwójnej nici DNA i przesuniętych o około pół skrętu helisy. Zgodnie z tym modelem, każdy kolejny 6 pz motyw pozwala na przyłączenie kolejnego dimeru białka Fur. Dodatkowo, taki układ potwierdza słuszność badań, które wskazują, że dimery Fur owijają się wokół podwójnej helisy [44].

Klasyczny model regulacji z udziałem białka Fur opiera się na wiązaniu z DNA dimerów tego białka w kompleksach z żelazem (Fe²⁺) jako kofaktorem (holo-Fur). Udowodniono również, że aktywacja jak i represja genów jest możliwa z udziałem dimeru apo-Fur (bez udziału Fe²⁺) [45]. U H. pylori Fur może hamować ekspresję genów zarówno indukowanych obecnością żelaza (FeON), jak i tych, których ekspresja jest hamowana nadmiarem tego pierwiastka (FeOFF). Wykazano, że Fur w zależności od tego czy jest związany z żelazem czy nie, preferencyjnie wiąże się z konkretnymi motywami operatorów, i tak odwrócone powtórzenia TAA są istotne dla wiązania holo-Fur, podczas gdy motyw TCATT_n10TT jest rozpoznawany przez apo-Fur [46]. Co ciekawe obydwa typy sekwencji mogą występować jednocześnie w tych samych operatorach, a przykładem promotora zawierającego taką sekwencję jest promotor genu fur, który wiąże zarówno apojak i holo-Fur z takim samym powinowactwem [47]. Eksperyment przeprowadzony metodą chromatografii wykluczania (Size Exclusion Chromatography – SEC) pokazał, że w zależności od stężenia żelaza w środowisku Fur może tworzyć również formy multimeryczne. W roztworze Fur występuje jako dimer, a w obecności Fe²⁺/Mn²⁺ wiąże się z DNA jako dimer, tetramer, a nawet jako podwójny tetramer. Preferencyjnie apo-Fur wiąże się z DNA jako dimer, a holo-Fur jako tetramer [46]. Fur po przybraniu odpowiedniej konformacji wiąże się z DNA dzięki domenie wiążącej. Wykazano, że helisy H4 i H4’ oddziałują z dużym rowkiem DNA [36]. Badania z wykorzystaniem dystamycyny A, antybiotyku wiążącego się w małym rowku DNA w regionach bogatych w pary AT, wykazały wpływ tego leku na wiązanie holo-Fur już w małych ilościach. Duże stężenia dystamycyny A powodowało całkowite zahamowanie wiązania tej formy białka. Takiego efektu nie zaobserwowano dla apo-Fur. Regulacja typu FeOFF, ale nie FeON, jest podporządkowana wiązaniu do małego rowka DNA, co nie wyklucza możliwości wiązania Fur również w dużym rowku DNA. Wiązanie dwóch form białka Fur (apo- i holo-Fur), do różnych motywów w operatorach, w zależności od struktury przestrzennej DNA, może wyjaśniać udział Fur w regulacji ekspresji wielu genów zarówno w sposób negatywny jak i pozytywny [46].

Ilość białka Fur w komórce E. coli jest zaskakująco wysoka. Liczba cząsteczek białka sięga bowiem 5000 w fazie logarytmicznego wzrostu i dochodzi do aż 10000 w fazie stacjonarnej. Tak duże stężenie Fur jest prawdopodobnie związane z ilością genów (ponad 90 u E. coli), których ekspresja znajduje się pod jego kontrolą. W genomie E. coli gen fur zlokalizowany jest w obrębie bicistronowego operonu fldA-fur. Taki układ obecny jest również u innych patogenów, np. Klebsiella pneumoniae, H. influenzae czy Y. pestis. Gen fldA jest bardzo istotny dla życia bakterii, koduje on bowiem flawodoksynę – białko zawierające flawiny, które zaangażowane są w reakcje typu redoks. Istnieje duże prawdopodobieństwo, iż flawodoksyny odgrywają znaczącą rolę w utrzymywaniu odpowiedniego stężenia zredukowanych jonów żelazowych w cytoplazmie, co ułatwia tworzenie kompleksów Fe²⁺-Fur [5]. Ekspresja genów operonu fldA-fur jest indukowana poprzez system SoxRS w odpowiedzi na stres, wynikający z podwyższonego stężenia nadtlenków, powstałych w wyniku reakcji redoks [48]. Dodatkowo, gen fur posiada własny promotor, z którego zachodzi indukcja ekspresji w obecności regulatora OxyR, w odpowiedzi na zwiększone stężenie nadtlenku wodoru, co również związane jest z zachodzeniem reakcji utleniania i redukcji [49]. Okazuje się jednak, iż pomimo tak wyraźnej regulacji reakcje redoks zwiększają poziom ekspresji genu fur tylko dwukrotnie. Taki wynik ukazuje ciekawą zależność między reakcjami redoks a homeostazą żelazową. Zwiększenie liczby kopii białka Fur podczas zachodzenia tego rodzaju reakcji skutkuje wiązaniem większej ilości jonów Fe²⁺, zmniejszeniem wydajności transportu żelaza oraz indukcją systemów związanych z jego magazynowaniem. W efekcie dochodzi do znacznego zmniejszenia stężenia wolnego żelaza w komórce wywołanego zachodzeniem reakcji redoks [48]. Okazało się również, że gen fur podlega również słabej autoregulacji, a miejscem oddziaływania jest „Fur box” zlokalizowany w regionie międzygenowym operonu fldA-fur. Dodatkowo, wykazano udział kompleksu cAMP/CRP w regulacji ekspresji fur [44].

Proces adaptacji bakterii do zmieniających się parametrów fizykochemicznych środowiska możliwy jest dzięki funkcjonowaniu różnorodnych mechanizmów regulacyjnych. U E. coli oraz innych bakterii Gram-ujemnych, w efektywnym odbiorze, przekazywaniu i przetwarzaniu sygnałów biorą udział dwuskładnikowe systemy transdukcji sygnału, w tym szlak sygnałowy EnvZ/OmpR. EnvZ jest białkiem o aktywności kinazy i fosfatazy, zlokalizowanym w błonie cytoplazmatycznej i pełniącym funkcje sensora odbierającego sygnały środowiskowe. OmpR to cytoplazmatyczny regulator odpowiedzi, który w wyniku fosforylacji przez partnerską kinazę EnvZ, a co za tym idzie zmian konformacyjnych w białku, nabiera zdolności do przyłączania się do sekwencji regulatorowych w genach kontrolując pozytywnie lub negatywnie ich transkrypcję. U E. coli wykazano, iż białko OmpR pełni funkcję globalnego regulatora, który kontroluje różne procesy życiowe tej bakterii [50]. Analizy ekspresji promotorów dwóch operonów hemPRSTUV-1 i hemPRST-2 kodujących składowe systemu transportu hemu u Y. enterocolitica wykazały, iż OmpR, obok Fur, hamuje transkrypcję obu operonów poprzez bezpośrednie oddziaływanie z DNA w obrębie motywu –35 sekwencji promotorowej. Ponadto, wpływ OmpR na aktywność promotora hemPRSTUV-1 obserwowano zarówno w warunkach niedoboru, jak i nadmiaru żelaza [14].

Przeprowadzono szereg badań dotyczących regulacji systemów pozyskiwania żelaza/hemu in vitro oraz in vivo, tj. w zależności od lokalizacji patogenu w organizmie gospodarza i dostępności do różnych źródeł żelaza. U Y. enterocolitica wykazano, iż ekspresja genu kodującego receptor hemu HemR jest specyficzna tkankowo. Ekspresja hemR jest wyższa w śledzionie i otrzewnej, a niższa w wątrobie i jelitach. Ponadto ekspresja hemR in vivo, w otrzewnej jest wyższa niż ekspresja w warunkach in vitro, w podłożu pozbawionym żelaza. Badania te sugerują, iż mogą istnieć dodatkowe specyficzne sygnały, poza spadkiem stężenia jonów żelaza, pochodzące z organizmu gospodarza, które regulują transkrypcję hemR [10, 51].

W przypadku Y. pseudotuberculosis w kontroli ekspresji hmuRSTUV biorą udział co najmniej dwa globalne regulatory, Fur i IscR. U E. coli białko IscR (iron‐ sulphur cluster regulator), bezpośrednio lub pośrednio kontroluje ekspresję ∼ 40 genów [52, 53]. U Y. pseudotuberculosis IscR, kontroluje ekspresję systemu sekrecji III typu (T3SS) związanego z wirulencją, a także bierze udział w pozytywnej regulacji ekspresji hmuRSTUV [29, 54]. Ponieważ u E. coli stres oksydacyjny, a także ograniczenie dostępności tlenu i żelaza regulują aktywność IscR, to wydaje się, iż zarówno tlen jak i żelazo mogą stanowić ważne czynniki regulujące wychwyt hemu/hemoprotein ze środowiska, również u gatunków z rodzaju Yersinia [52, 55, 56]. U Vibrio vulnificus zaobserwowano natomiast współzawodnictwo między represorem Fur a pozytywnym regulatorem HupR. W środowisku o niskiej zawartości żelaza, gdy obecny jest hem, HupR może wiązać się z promotorem genu hupA, kodującym receptor hemowy błony zewnętrznej, aby indukować jego ekspresję. W warunkach wysokiego stężenia żelaza Fe⁺²-Fur wiąże się z promotorem hupA, hamując jego ekspresję, tym samym zapobiegając wiązaniu HupR [57].

Indukowane termicznie zmiany strukturalne w mRNA pełnią fundamentalną rolę w termoregulacji ekspresji czynników zjadliwości u wielu bakterii chorobotwórczych [58–60]. Jak sugerują badania, pobieranie hemu przez bakterie może być regulowane w odpowiedzi na zmianę temperatury otoczenia. Termoregulację ekspresji genów transportu hemu opisano u niektórych bakterii chorobotwórczych, które są zdolne do przeżycia wewnątrz organizmu gospodarza (∼ 37°C) jak i na zewnątrz, tj. w temp. ok. 25°C. Ponieważ organizm gospodarza jest środowiskiem bogatym w hem, w 37°C u bakterii zachodzi ekspresja genów niezbędnych do wychwytu hemu, natomiast w 25°C, w środowisku pozbawionym tego związku, ekspresja genów jest wyciszona, gdyż byłaby zbędnym wydatkiem energetycznym. Potranskrypcyjny mechanizm termoregulacji dotyczy m. in. ekspresji genu shuA, kodującego receptor hemu zlokalizowany w błonie zewnętrznej Shigella dysenteriae. Za proces ten odpowiada fragment regionu 5’UTR mRNA shuA pełniący funkcję swoistego termometru [61]. Termosensory w komórkach bakteryjnych, poprzez tworzenie wiązań pomiędzy zasadami mRNA (model zamka błyskawicznego), regulują ekspresję genów wirulencji i szoku cieplnego w odpowiedzi na zmiany temperatury w środowisku [62]. W niskiej temperaturze obecność struktury II-rzędowej w mRNA, w miejscu wiązania rybosomu, hamuje proces translacji. Z chwilą wzrostu temperatury, dochodzi do rozwinięcia struktury II-rzędowej, co prowadzi do uruchomienia translacji. Dane literaturowe wskazują, iż w wyniku funkcjonowania opisanego mechanizmu potranskrypcyjnej regulacji u S. dysenteriae w 37°C obserwuje się zwiększoną ekspresję genu shuA, a co za tym idzie zwiększony poziom syntezy receptora ShuA. Za tę regulację jest odpowiedzialny fragment 5’UTR mRNA shuA złożony z ciągu czterech uracyli (FourU). Taki typ termosensora zidentyfikowano także w genie chuA receptora hemu E. coli UPEC oraz udowodniono termoregulację syntezy receptora ChuA, co sugeruje iż ten mechanizm potranskrypcyjnej regulacji może występować także w innych gatunkach bakterii [61]. Chociaż w 5’UTR mRNA hemR Y. enterocolitica zidentyfikowano ciąg FourU to poziom HemR w komórce tego patogenu nie podlega termoregulacji [14].

Inny mechanizm potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów wiąże się z obecnością/aktywnością małych regulatorowych RNA (sRNA), które pełnią istotną funkcję w szybkiej odpowiedzi komórek na zmiany zachodzące w środowisku. W ciągu ostatniej dekady wiele sRNA zostało zidentyfikowanych jako regulatory różnych procesów komórkowych, takich jak synteza białek błony zewnętrznej [63], metabolizm [64], patogeneza [65–67], ruchliwość/produkcja biofilmu [68, 69]. W regulacji ekspresji genów związanych z transportem żelaza u E. coli zidentyfikowano mały regulatorowy sRNA RyhB. Udowodniono, że RyhB pełni kluczową rolę w homeostazie żelaza regulując ekspresję co najmniej 50 różnych genów kodujących białka zaangażowane w transport i wykorzystanie tego pierwiastka [70]. RyhB może działać na dwa sposoby, przede wszystkim wyciszając ekspresję genów poprzez hamowanie translacji i destabilizację/degradację docelowego mRNA, oraz rzadziej promując ekspresję genów [71]. Regulacja negatywna z udziałem RyhB polega na parowaniu sRNA/mRNA, które zazwyczaj zachodzi w miejscu inicjacji translacji (na odcinku ok. 50 nt, zawierającym RBS oraz kodon start translacji regulowanego genu). Przyłączenie tego sRNA prowadzi do zahamowania inicjacji translacji i degradacji dupleksów sRNA/mRNA przez RNazę E [72, 73]. Aby zaszło parowanie RyhB z mRNA wymagane jest białko chaperonowe Hfq [74]. Homologi RyhB zostały opisane u wielu gatunków bakterii, głównie w rodzinie Enterobacteriaceae [66, 70, 75, 76]. Co ciekawe niektóre gatunki bakterii kodują dwa sRNA RyhB w swoim genomie, a rola każdego z nich może być podobna bądź zupełnie różna. Do takich gatunków należą Salmonella sp. [77, 78], Y. pestis [79] i K. pneumoniae [80]. RyhB-zależna regulacja ekspresji genów odpowiedzialnych za transport żelaza wynika głównie z oddziaływania dwóch regulatorów, RyhB i Fur, na zasadzie negatywnego sprzężenia zwrotnego, gdzie (i) ekspresja ryhB jest hamowana przez Fur [81], (ii) ekspresja fur jest hamowana przez RyhB [82]. Poza tym, że RyhB uczestniczy w kontroli ekspresji genów poprzez modulowanie transkrypcji represora Fur, ma również wiele bezpośrednich celów wśród genów kodujących białka odpowiedzialne za transport i pozyskiwanie żelaza, tj. (i) shiA – gen transportera kwasu szikimowego [83], (ii) cirA – gen receptora w błonie zewnętrznej [84], (iii) bfr – gen bakterioferrytyny [81], (iv) febB – gen białka wiążącego enterobaktynę [84], (v) hemH, hemB, hemN – geny białek zaangażowanych w biosyntezę hemu [85].